高效液相色譜法的主要類型及其分離原理

　　根據(jù)分離機(jī)制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：1 。液 — 液分配色譜法Liquid-liquid Partition Chromatography及化學(xué)鍵合相色譜Chemically Bonded Phase Chromatography流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配。達(dá)到平衡時，服從于下式：

　　式中，cs—溶質(zhì)在固定相中濃度;cm--溶質(zhì)在流動相中的濃度; Vs—固定相的體積;Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大;但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。

　　a. 正相液 — 液分配色譜法Normal Phase liquid Chromatography: 流動相的極性小于固定液的極性。

　　b. 反相液 — 液分配色譜法Reverse Phase liquid Chromatography: 流動相的極性大于固定液的極性。

　　c. 液 — 液分配色譜法的缺點(diǎn)：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解;流動相通過色譜柱時的機(jī)械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見后），可克服上述缺點(diǎn)?，F(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（70——80%）。

　　液 — 固色譜法流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進(jìn)行分離的。其作用機(jī)制是：當(dāng)試樣進(jìn)入色譜柱時，溶質(zhì)分子 X 和溶劑分子S對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附（未進(jìn)樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm式中：Xm--流動相中的溶質(zhì)分子;Sa--固定相中的溶劑分子;Xa--固定相中的溶質(zhì)分子;Sm--流動相中的溶劑分子。

　　當(dāng)吸附競爭反應(yīng)達(dá)平衡時：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]式中：K為吸附平衡常數(shù)。[討論：K越大，保留值越大。]3 。離子交換色譜法Ion-exchange ChromatographyIEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，依據(jù)這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。

　　以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：X-溶劑中 樹脂-R4N Cl-=== 樹脂-R4N X- Cl- 溶劑中當(dāng)交換達(dá)平衡時：KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-]分配系數(shù)為：DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-][討論：DX與保留值的關(guān)系]凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進(jìn)行分離。

　　4 。離子對色譜法Ion Pair Chromatography離子對色譜法是將一種 或多種 與溶質(zhì)分子電荷相反的離子 稱為對離子或反離子 加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保留行為。其原理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機(jī)相式中：X 水相--流動相中待分離的有機(jī)離子（也可是陽離子）;Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）;X Y---形成的離子對化合物。

　　當(dāng)達(dá)平衡時：KXY = [X Y-]有機(jī)相/[ X ]水相[Y-]水相根據(jù)定義，分配系數(shù)為：DX= [X Y-]有機(jī)相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相[討論：DX與保留值的關(guān)系]離子對色譜法特別是反相發(fā)解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、堿和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物堿以及藥物等分離。

　　5 。離子色譜法Ion Chromatography用離子交換樹脂為固定相，電解質(zhì)溶液為流動相。以電導(dǎo)檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強(qiáng)電解質(zhì)背景離子對電導(dǎo)檢測器的干擾，設(shè)置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應(yīng)原理與離子交換色譜法相同。

　　以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當(dāng)待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進(jìn)入色譜柱時，發(fā)生如下交換反應(yīng)（洗脫反應(yīng)為交換反應(yīng)的逆過程）：

　　抑制柱上發(fā)生的反應(yīng)：R-H Na OH- === R-Na H2OR-H Na Br- === R-Na H Br-可見，通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變成了電導(dǎo)值很小的水，消除了本底電導(dǎo)的影響;試樣陰離子Br-則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸H Br-，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測。

　　6 ?？臻g排阻色譜法Steric Exclusion Chromatography空間排阻色譜法以凝膠 gel 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進(jìn)行分離，而是按分子大小進(jìn)行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進(jìn)入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進(jìn)入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進(jìn)入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。