MALDI-TOF MS已進(jìn)臨床微生物實(shí)驗(yàn)室 或成細(xì)菌鑒定領(lǐng)域“主力軍”

　　隨著科技的不斷進(jìn)步、相信在不久的將來，MALDI-TOF MS必將成為細(xì)菌鑒定領(lǐng)域的“主力軍”。

　　隨著技術(shù)的不斷成熟和廣泛使用，其在微生物檢驗(yàn)常規(guī)診斷中的作用越來越受到關(guān)注，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（ MALDI-TOF MS）已經(jīng)進(jìn)入臨床微生物實(shí)驗(yàn)室。

　　自20世紀(jì)80年代起，質(zhì)譜技術(shù)就已經(jīng)成為科學(xué)研究中用于蛋白分析的強(qiáng)大工具。隨著技術(shù)的不斷成熟和廣泛使用，其在微生物檢驗(yàn)常規(guī)診斷中的作用越來越受到關(guān)注，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）已經(jīng)進(jìn)入臨床微生物實(shí)驗(yàn)室用于病原菌鑒定，與傳統(tǒng)的表型鑒定及分子生物學(xué)技術(shù)相比，MALDI-TOF MS快速、準(zhǔn)確、成本低廉，且數(shù)據(jù)庫可不斷更新完善，極大地提高了臨床微生物尤其是微需氧菌、厭氧菌、分枝桿菌及真菌等難培養(yǎng)微生物的鑒定效率，盡管該技術(shù)推向臨床不到10年，現(xiàn)已被公認(rèn)為微生物快速鑒定的里程碑。

　　MALDI-TOF MS基本原理

　　MALDI-TOF MS 的離子源通過激光轟擊待測樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，使基質(zhì)從中吸收能量并傳遞給生物分子，二者間發(fā)生質(zhì)子（ 即電荷） 轉(zhuǎn)移而使生物分子電離。電離的生物分子在電場作用下加速通過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器的時間及離子的數(shù)量得到質(zhì)/荷（ m/z） 比值及信號值而形成相應(yīng)的峰圖。

　　微生物由其自身獨(dú)特的蛋白質(zhì)組成，通過比對MALDI-TOF MS 獲得種屬間的特異峰圖（ 主要由核糖體蛋白形成，m/z 范圍為2000——20000） 與數(shù)據(jù)庫中的參考譜圖，根據(jù)同源性距離得到最接近的菌種并給出相應(yīng)的鑒定分值，再依據(jù)實(shí)際情況分析，可得到最終的鑒定結(jié)果。值得一提的是，MALDI與其他電離方式相比具有很多優(yōu)勢，其電離方式為“軟電離”——整個分子在離子化過程中都能夠保持完整，得出的質(zhì)譜圖就會讓不同大小的分子有序排布，這樣就便于我們對譜圖進(jìn)行分析。而其他電離方式更加激烈一些，會導(dǎo)致分子碎裂，最后得出的譜圖會產(chǎn)生很大干擾，造成分析困難。

　　MALDI-TOF MS的應(yīng)用領(lǐng)域

　　1.臨床病原微生物

　　MALDI-TOF MS 不但可用于分純菌落，也可用于某些特定臨床標(biāo)本的直接檢測，包括陽性血培養(yǎng)液、中段尿、腦脊液等樣本中微生物的鑒定。該技術(shù)也可用于臨床病毒感染的診斷、病毒基因分型和流行病學(xué)研究。

　　2.食源性微生物

　　該技術(shù)在飲用水被污染的早期就能直接鑒定出病原菌，已成功用于食品微生物的檢測，并建立了食源性致病菌蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。

　　3.環(huán)境微生物

　　MALDI-TOF MS 在環(huán)境微生物的鑒定中也日益受到重視，例如海洋、大氣、土壤等特定環(huán)境中的潛在致病微生物。以上棲息地的微生物種類繁多，MALDI-TOF MS 在準(zhǔn)確鑒定微生物的同時，將來自不同環(huán)境和地域的同一種微生物通過MALDI Biotyper 軟件的聚類分析功能進(jìn)行溯源。目前已經(jīng)初步建立了環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫。

　　4. 其他領(lǐng)域

　　MALDI-TOF MS 在新的生物學(xué)標(biāo)志物篩選、新生兒遺傳代謝病臨床應(yīng)用中也具有很好的應(yīng)用前景，有可能成為個體化醫(yī)療中快速精準(zhǔn)的檢測技術(shù)。例如先天性甲狀腺功能減退癥、苯丙酮尿癥、囊胞性纖維癥、半乳糖血癥、氧化脂肪酸缺陷癥、有機(jī)酸尿癥和尿素循環(huán)缺陷癥等。

　　MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫現(xiàn)狀

　　目前主要有4 種MALDI-TOF MS 系統(tǒng)： MALDI Biotyper系統(tǒng)（ Bruker Daltonics，德國）；VITEK MS 系統(tǒng)（ BioMérieux，Marcy l＇Etoile，法國）；the AXIMA @ SARAMIS 數(shù)據(jù)庫（ AnagnosTec，德國） 和the Andromas（ Andromas，法國）。而可購買到的數(shù)據(jù)庫有3 種： MALDI Biotyper 數(shù)據(jù)庫（ 布魯克道爾頓，德國） ，Saramis（ BioMérieux，用于來自Shimadzu 的質(zhì)譜設(shè)備） 和Andromas （ 可與布魯克道爾頓或Shimadzu 硬件兼容）。其中MALDI Biotyper 和VITEK MS 系統(tǒng)已獲得中國食品和藥品監(jiān)督管理局的許可證，可用于臨床樣本的檢測。MALDI Biotyper 和VITEK MS 系統(tǒng)對應(yīng)的臨床微生物基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫分別為Biotyper 2.0 database 和Vitek MS plus Saramis Knowledge base 2.0。Biotyper 2.0 database中包含的菌種豐富，但缺乏志賀菌（ 與大腸埃希菌親緣性過近，常規(guī)比對算法無法區(qū)分） ，且分枝桿菌、絲狀真菌、布魯氏菌以及霍亂弧菌等所在數(shù)據(jù)庫需單獨(dú)購買; Vitek MS plus Saramis Knowledge base2.0 中包含的菌種少于Biotyper 2.0 database，但擁有霍亂弧菌的數(shù)據(jù)。

　　對于其中缺少的菌種，我們除了通過購買其他數(shù)據(jù)庫獲得，還可通過自建數(shù)據(jù)庫來加以完善，那么該如何進(jìn)行自建呢？

　?。?） 通過生化反應(yīng)或基因測序鑒定并確認(rèn)待入庫菌的種名；

　?。?） 分純單菌落以獲得足量單克隆株；

　?。?） 樣本制備： 根據(jù)待入庫菌蛋白質(zhì)提取難度及日后鑒定的需要，靈活選用前處理方法；

　?。?） 自動或手動采集質(zhì)譜譜圖；

　　（5） 譜圖評估篩選： 選擇20 —— 24 張質(zhì)量較好的譜圖，減小偶然誤差；

　?。?） 操作軟件完成建庫。

　　MALDI-TOF MS 數(shù)據(jù)庫擴(kuò)展完善的重要性

　　數(shù)據(jù)庫是MALDI-TOF MS 的核心，待檢測微生物只有在數(shù)據(jù)庫里有相應(yīng)的質(zhì)譜圖才可能被鑒定。數(shù)據(jù)庫不僅要包含微生物所有的屬，也應(yīng)包括種，甚至株。質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫完善意義重大，具體原因如下：

　　1.分類詞目不斷增加，新物種不斷被發(fā)現(xiàn)。有時待測微生物未能被鑒定出來是因?yàn)樗切碌奈锓N或分類。比如過氧化物酶陰性的革蘭陽性球菌有許多新種類，而且其分類也在不斷發(fā)展。只有制造商或者用戶把新發(fā)現(xiàn)的物種添加到數(shù)據(jù)庫，按照物種分類詞目的變化去完善數(shù)據(jù)庫，才能保證新物種的準(zhǔn)確鑒定。

　　2.有一些物種遺傳背景很相近，親緣性高，增加了鑒別的難度?，F(xiàn)在還不清楚是否可以通過優(yōu)化數(shù)據(jù)庫或者軟件使一些同源性高度相近的微生物的鑒別成為可能，但像這樣的細(xì)節(jié)如果不被考慮，就會造成鑒定錯誤。

　　3.微生物標(biāo)本有可能來自不同地域，不同分離基物，有不同分離年限，而且不同地域的優(yōu)勢菌不同，數(shù)據(jù)庫中微生物單一的參考質(zhì)譜圖有時并不能代表分離自其他微生物實(shí)驗(yàn)室的同種典型菌株。所以數(shù)據(jù)庫中應(yīng)包含同一個菌種采集的多個分離株的指紋質(zhì)譜圖，用戶可以將分離的本地典型菌株作為參考菌株填充到自定義數(shù)據(jù)庫中，必要時可考慮對某些微生物建立本地數(shù)據(jù)庫，甚至可以建立多地區(qū)數(shù)據(jù)庫聯(lián)網(wǎng)共享。

　　4.分枝桿菌、厭氧菌等疑難鑒定微生物，其數(shù)據(jù)庫的建立和完善更為必要。

　　5.商業(yè)數(shù)據(jù)庫中對環(huán)境微生物的指紋圖譜很少。由于MALDI-TOF MS 越來越多用于鑒定環(huán)境微生物，因此構(gòu)建環(huán)境微生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫是新的研究方向。很多研究也表明，質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)大可以使鑒定正確率大大提高。例如分枝桿菌在數(shù)據(jù)庫擴(kuò)展前后的鑒定正確率分別79.3%和94.9%。因此數(shù)據(jù)庫的更新和完善是運(yùn)用MALDI-TOF MS 技術(shù)正確鑒定微生物的基礎(chǔ)。

　　MALDI-TOF MS未來展望

　　MALDI-TOF MS在不久的將來肯定會取代傳統(tǒng)的生化鑒定法，在實(shí)驗(yàn)室大力推廣。在西歐，MALDI-TOF MS已經(jīng)在臨床實(shí)驗(yàn)室使用，目前FDA和美國抗生素委員會也正在討論將這一方法在臨床推廣，這也將帶來細(xì)菌鑒定及耐藥性檢測的革命。

　　目前，MALDI-TOF MS仍存在不少問題值得繼續(xù)研究改進(jìn)，比如不同的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間、上樣方式等因素影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性、數(shù)據(jù)庫尚不完善、從原始標(biāo)本中直接進(jìn)行檢測涉及到的最低細(xì)菌量以及感染性標(biāo)本的防護(hù)、或是在同一標(biāo)本中分離出多種進(jìn)化程度相近的物種則會難以辨別等等。但是另一方面，由于該項技術(shù)具備快速、靈敏、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、分辨率高、對原始樣本要求低等優(yōu)點(diǎn)，令其在臨床微生物領(lǐng)域具有很大的發(fā)展前景。隨著科技的不斷進(jìn)步、相信在不久的將來，MALDI-TOF MS必將成為細(xì)菌鑒定領(lǐng)域的“主力軍”。